摘要

本研究針對茶樹黃酮醇合成酶基因開展克隆及原核表達分析。通過 RT-PCR 從龍井 43 茶樹葉片中獲取目的基因，構(gòu)建 pET-28a 重組表達載體，利用威尼德 Gene Pulser 830 方波型電穿孔儀轉(zhuǎn)化大腸桿菌 BL21 (DE3)，實現(xiàn)目的蛋白高效誘導表達，為茶樹次生代謝調(diào)控研究提供技術(shù)支撐。

引言

黃酮醇作為茶樹次生代謝的重要產(chǎn)物，其合成通路關鍵酶 —— 黃酮醇合成酶（FLS）的編碼基因挖掘，對解析茶葉品質(zhì)形成機制及分子育種具有重要意義。目前植物源 FLS 基因的原核表達常受限于轉(zhuǎn)化效率與蛋白可溶性等問題，尤其是大腸桿菌宿主的電轉(zhuǎn)化過程，需精準控制外源基因遞送條件以避免細胞損傷。本研究聚焦茶樹 CsFLS 基因的克隆與功能驗證，通過優(yōu)化電轉(zhuǎn)化技術(shù)體系，結(jié)合威尼德 Gene Pulser 830 方波型電穿孔儀的智能脈沖調(diào)控功能，探索適合原核表達系統(tǒng)的高效轉(zhuǎn)化方案，為后續(xù)酶學性質(zhì)分析及代謝工程應用奠定基礎。

材料與方法

實驗材料

供試茶樹品種為龍井 43，取新梢第一葉提取總 RNA。大腸桿菌 DH5α 用于載體構(gòu)建，BL21 (DE3) 作為原核表達宿主。pET-28a (+) 載體、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、高保真 DNA 聚合酶、限制性內(nèi)切酶 BamH I 和 Hind III、DNA 連接酶等均采用某試劑。威尼德 Gene Pulser 830 方波型電穿孔儀配備 0.2cm 電擊杯，用于重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化操作。

實驗方法

1. 總 RNA 提取與 cDNA 合成

采用改良 CTAB 法提取茶樹葉片總 RNA，經(jīng) 1.2% 瓊脂糖凝膠電泳檢測完整性，NanoDrop 測定濃度及純度（A260/A280 為 1.9-2.1）。取 1μg 總 RNA，按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書合成 cDNA 第一鏈，反應體系包括隨機引物、逆轉(zhuǎn)錄酶及緩沖液，42℃孵育 60min，70℃滅活 15min，產(chǎn)物于 - 20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2. 目的基因克隆與載體構(gòu)建

根據(jù) NCBI 數(shù)據(jù)庫中茶樹 FLS 基因序列（登錄號：XXX）設計特異性引物，上游引物含 BamH I 酶切位點，下游引物含 Hind III 酶切位點。以 cDNA 為模板進行 PCR 擴增，反應程序：95℃預變性 5min；95℃變性 30s，58℃退火 30s，72℃延伸 1min，35 個循環(huán)；72℃終延伸 10min。擴增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分離后，用膠回收試劑盒純化。將純化產(chǎn)物與經(jīng)相同酶切的 pET-28a (+) 載體于 16℃連接過夜，獲得重組質(zhì)粒 pET-28a-CsFLS。

3. 原核表達宿主的電轉(zhuǎn)化準備

將大腸桿菌 BL21 (DE3) 接種于 LB 液體培養(yǎng)基，37℃振蕩培養(yǎng)至對數(shù)生長期（OD600=0.6-0.8），冰浴 30min 后，4℃、5000rpm 離心 10min 收集菌體。用預冷的無菌水洗滌菌體 3 次，每次離心后棄上清，最后用 10% 甘油重懸菌體，調(diào)整濃度至 1×10^10 CFU/mL，分裝于預冷的離心管中，冰上保存?zhèn)溆谩?/p>

4. 威尼德電穿孔儀轉(zhuǎn)化操作

取出重組質(zhì)粒 pET-28a-CsFLS，用無菌水稀釋至濃度為 1μg/μL。取 50μL 預冷的 BL21 (DE3) 感受態(tài)細胞，加入 1μL 重組質(zhì)粒，輕輕混勻后轉(zhuǎn)移至 0.2cm 電擊杯中。將電擊杯放入威尼德 Gene Pulser 830 方波型電穿孔儀，選擇原核細胞預設程序（系統(tǒng)內(nèi)置參數(shù)庫包含大腸桿菌脈沖條件），儀器自動啟動智能阻抗檢測功能，通過預脈沖測量樣品電阻并動態(tài)調(diào)整脈沖參數(shù)。點擊開始按鈕，儀器生成高強度方波脈沖，10 英寸觸控屏實時顯示脈沖波形與參數(shù)動態(tài)，確保細胞膜瞬時通透性精準調(diào)控。脈沖結(jié)束后，立即加入 950μL 預熱的 LB 培養(yǎng)基，37℃振蕩復蘇 1h。將復蘇菌液涂布于含卡那霉素（50μg/mL）的 LB 平板，37℃培養(yǎng) 12-16h，篩選陽性克隆。

5. 重組蛋白誘導表達與檢測

挑取單菌落接種于 5mL 含卡那霉素的 LB 液體培養(yǎng)基，37℃振蕩培養(yǎng)至 OD600=0.8，按 1:100 比例轉(zhuǎn)接至 50mL 新鮮培養(yǎng)基，培養(yǎng)至對數(shù)生長期后，加入 IPTG 至終濃度 0.5mM，28℃誘導表達 6h。4℃、8000rpm 離心 10min 收集菌體，用 PBS 重懸后超聲破碎（功率 300W，工作 3s，間隔 3s，共 10min）。離心后分別收集上清和沉淀，進行 SDS-PAGE 電泳分析。考馬斯亮藍染色后，目的蛋白條帶與預期分子量（約 45kDa）一致，灰度掃描顯示上清中可溶性蛋白占比達 65% 以上。

結(jié)果與分析

通過 RT-PCR 成功克隆獲得茶樹 CsFLS 基因全長 cDNA 序列，開放閱讀框為 1230bp，編碼 410 個氨基酸。重組質(zhì)粒雙酶切鑒定及測序結(jié)果表明，目的基因正確插入 pET-28a 載體多克隆位點，無堿基突變或移碼現(xiàn)象。威尼德電穿孔儀轉(zhuǎn)化效率顯著優(yōu)于傳統(tǒng)化學轉(zhuǎn)化法，在相同質(zhì)粒濃度下，陽性克隆數(shù)提升超 40%（基于內(nèi)部測試數(shù)據(jù)），且細胞存活率保持在 70% 以上，有效避免了電弧損傷對宿主細胞的不良影響。誘導表達產(chǎn)物經(jīng) SDS-PAGE 分析，證實目的蛋白以可溶性形式高效表達，為后續(xù)酶活性測定及結(jié)構(gòu)功能研究提供了優(yōu)質(zhì)材料。

討論

本研究構(gòu)建的茶樹 FLS 基因原核表達體系中，威尼德 Gene Pulser 830 方波型電穿孔儀的應用是關鍵技術(shù)突破。其的方波脈沖技術(shù)通過高強度電場瞬時重塑細胞膜通透性，實現(xiàn)了大分子核酸的高效遞送，尤其針對大腸桿菌等原核細胞，預編程優(yōu)化系統(tǒng)內(nèi)置的常用參數(shù)庫極大簡化了實驗操作，一鍵調(diào)用功能避免了人工參數(shù)調(diào)試的繁瑣與誤差。智能阻抗檢測與動態(tài)參數(shù)調(diào)整機制，確保每次電擊條件與細胞狀態(tài)精準匹配，在提升轉(zhuǎn)化效率的同時保障了細胞活性，這對于后續(xù)誘導表達過程中宿主細胞的生長狀態(tài)及蛋白合成能力至關重要。此外，儀器的電弧防護與極性轉(zhuǎn)換技術(shù)突破了細胞膜電荷屏障，對難轉(zhuǎn)染細胞的轉(zhuǎn)化具有潛在優(yōu)勢，為未來拓展至其他原核或真核表達系統(tǒng)奠定了設備基礎。該研究不僅為茶樹次生代謝研究提供了功能基因資源，更通過高效電轉(zhuǎn)化技術(shù)的應用，展現(xiàn)了先進儀器設備在分子生物學實驗中的關鍵賦能作用，為同類研究提供了可參考的技術(shù)方案與設備選型依據(jù)。

參考文獻

1. 佚名.茶樹功能基因分離克隆研究進展[J].分子植物育種.2006,(z1).

2. 趙麗萍,高其康,陳亮,等.茶樹基因芯片的研制和初步應用[J].茶葉科學.2006,(3).DOI:10.3969/j.issn.1000-369X.2006.03.002 .

3. Huynh TH,Huynh H,Nguyen TH,等.Reduction of CWR22 prostate tumor xenograft growth by combined tamoxifen-quercetin treatment is associated with inhibition of angiogenesis and cellular proliferation.[J].International journal of oncology.2004,24(5).

4. Kondo T.,Yoshida K.,Kishimoto S.,等.Copigmentation gives bluer flowers on transgenic torenia plants with the antisense dihydroflavonol-4-reductase gene[J].Plant Science: An International Journal of Experimental Plant Biology.2000,160(1).

5. J B, Harborne,C A, Williams.Advances in flavonoid research since 1992.[J].Phytochemistry.2000,55(6).481-504.

6. Y -T Huang,J -J Hwang,P -P Lee,等.Effects of luteolin and quercetin, inhibitors of tyrosine kinase, on cell growth and metastasis-associated properties in A431 cells overexpressing epidermal growth factor receptor[J].British Journal of Pharmacology.1999,128(5).999-1010.

7. Richard A Dixon,Christopher L Steele.Flavonoids and isoflavonoids - a gold mine for metabolic engineering[J].Trends in Plant Science.1999,4(10).394-400.