摘要

巴斯德畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)高效分泌表達(dá)胱抑素C，通過(guò)優(yōu)化培養(yǎng)條件及誘導(dǎo)參數(shù)提高蛋白產(chǎn)量。采用某品牌純化系統(tǒng)獲得高純度胱抑素C，并評(píng)估其免疫原性。結(jié)果表明，重組胱抑素C具有良好抗原性，為后續(xù)抗體開(kāi)發(fā)及診斷應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

引言

胱抑素C是一種低分子量蛋白質(zhì)，廣泛存在于各種體液中，作為腎小球?yàn)V過(guò)率的重要標(biāo)志物，在臨床診斷中具有重要價(jià)值。傳統(tǒng)獲取胱抑素C的方法多從人尿中提取，但產(chǎn)量低且純度難以保證。近年來(lái)，重組DNA技術(shù)的發(fā)展為大規(guī)模生產(chǎn)重組胱抑素C提供了新思路。

巴斯德畢赤酵母（Pichia pastoris）作為一種高效的真核表達(dá)系統(tǒng)，具有蛋白翻譯后修飾能力強(qiáng)、分泌表達(dá)效率高、培養(yǎng)成本低等優(yōu)勢(shì)，已成為重組蛋白生產(chǎn)的理想宿主。本研究旨在利用巴斯德畢赤酵母系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)胱抑素C的高效分泌表達(dá)，并通過(guò)系統(tǒng)優(yōu)化提高產(chǎn)量，同時(shí)評(píng)估其免疫原性，為開(kāi)發(fā)胱抑素C相關(guān)診斷試劑及抗體藥物提供物質(zhì)基礎(chǔ)。

材料與方法

1. 菌株與載體

實(shí)驗(yàn)選用巴斯德畢赤酵母GS115菌株作為宿主，表達(dá)載體為某品牌分泌型載體pPIC9K，該載體含有AOX1強(qiáng)啟動(dòng)子及α-factor信號(hào)肽序列，可實(shí)現(xiàn)外源蛋白的分泌表達(dá)。

2. 基因克隆與載體構(gòu)建

根據(jù)GenBank中胱抑素C基因序列（登錄號(hào)：XXX），設(shè)計(jì)特異性引物引入某品牌限制性?xún)?nèi)切酶位點(diǎn)。以人肝cDNA為模板，通過(guò)某品牌高保真PCR酶擴(kuò)增目的基因。PCR產(chǎn)物經(jīng)某品牌凝膠回收試劑純化后，與線(xiàn)性化載體通過(guò)某品牌快速連接酶連接，轉(zhuǎn)化某品牌大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞。陽(yáng)性克隆經(jīng)某品牌測(cè)序服務(wù)驗(yàn)證正確性。

3. 酵母轉(zhuǎn)化與篩選

將驗(yàn)證正確的重組質(zhì)粒用某品牌限制性?xún)?nèi)切酶線(xiàn)性化后，通過(guò)威尼德電穿孔儀電轉(zhuǎn)導(dǎo)入巴斯德畢赤酵母GS115感受態(tài)細(xì)胞。轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂布于含某品牌G418的MD平板，篩選高拷貝轉(zhuǎn)化子。陽(yáng)性克隆進(jìn)一步通過(guò)某品牌PCR試劑及某品牌Western blot試劑驗(yàn)證。

4. 表達(dá)條件優(yōu)化

4.1 培養(yǎng)條件優(yōu)化

挑選高表達(dá)克隆接種于BMGY培養(yǎng)基（1%酵母提取物，2%蛋白胨，1.34% YNB，4×10-5%生物素，1%甘油），30℃、250 rpm振蕩培養(yǎng)至OD600=2-6。離心收集菌體，重懸于BMMY培養(yǎng)基（含0.5%甲醇誘導(dǎo)），設(shè)置不同誘導(dǎo)條件：

溫度梯度：20℃、25℃、30℃

pH梯度：5.0、6.0、7.0

甲醇濃度：0.5%、1.0%、1.5%

誘導(dǎo)時(shí)間：24 h、48 h、72 h

4.2 補(bǔ)料策略?xún)?yōu)化

采用分批補(bǔ)料培養(yǎng)模式，初始甘油濃度為4%，當(dāng)OD600達(dá)到20時(shí)開(kāi)始流加50%甘油；當(dāng)OD600達(dá)到100時(shí)，切換為甲醇誘導(dǎo)，維持甲醇濃度在0.5-1.0%。

5. 蛋白純化

培養(yǎng)上清經(jīng)某品牌離心機(jī)10000×g離心20 min去除菌體，上清液通過(guò)某品牌0.22 μm濾膜過(guò)濾。采用某品牌AKTA純化系統(tǒng)，依次經(jīng)過(guò)：

陽(yáng)離子交換層析：某品牌SP Sepharose FF柱，20 mM磷酸鈉緩沖液（pH 6.0）平衡，0-1 M NaCl梯度洗脫

分子篩層析：某品牌Superdex 75柱，PBS緩沖液洗脫

純化過(guò)程通過(guò)某品牌SDS-PAGE試劑和某品牌Western blot試劑監(jiān)測(cè)。蛋白濃度采用某品牌BCA蛋白定量試劑測(cè)定。

6. 免疫原性分析

6.1 動(dòng)物免疫

將純化的重組胱抑素C（100 μg/只）與某品牌弗氏佐劑等體積乳化，皮下免疫6-8周齡BALB/c小鼠（n=6）。加強(qiáng)免疫使用弗氏不佐劑，間隔2周免疫一次，共免疫3次。末次免疫7天后采集血清。

6.2 抗體效價(jià)測(cè)定

采用某品牌ELISA試劑測(cè)定血清抗體效價(jià)：

包被：96孔板包被1 μg/mL重組胱抑素C，4℃過(guò)夜

封閉：3% BSA，37℃ 1 h

孵育：系列稀釋的小鼠血清，37℃ 1 h

檢測(cè)：某品牌HRP標(biāo)記二抗，TMB顯色，某品牌酶標(biāo)儀測(cè)定OD450

6.3 抗體特異性分析

通過(guò)某品牌Western blot試劑分析抗體特異性：

電泳：純化蛋白及細(xì)胞裂解液經(jīng)某品牌SDS-PAGE試劑分離

轉(zhuǎn)膜：威尼德半干轉(zhuǎn)膜儀轉(zhuǎn)至某品牌PVDF膜

封閉：5%脫脂牛奶，室溫1 h

孵育：免疫小鼠血清（1:1000稀釋?zhuān)?℃過(guò)夜

檢測(cè)：某品牌ECL發(fā)光試劑顯影

結(jié)果

1. 重組菌株構(gòu)建與驗(yàn)證

成功構(gòu)建pPIC9K-CysC重組質(zhì)粒，經(jīng)某品牌測(cè)序證實(shí)序列正確。威尼德電穿孔儀轉(zhuǎn)化效率達(dá)1×104 CFU/μg DNA。某品牌PCR試劑和某品牌Western blot試劑驗(yàn)證證實(shí)目的基因已整合至酵母基因組并正確表達(dá)。

2. 表達(dá)條件優(yōu)化結(jié)果

最佳表達(dá)條件為：誘導(dǎo)溫度25℃、pH 6.0、甲醇濃度1.0%、誘導(dǎo)時(shí)間72 h。在此條件下，胱抑素C分泌表達(dá)量達(dá)120 mg/L，較初始條件提高3.5倍。補(bǔ)料培養(yǎng)策略使最終菌體密度（OD600）達(dá)180，蛋白產(chǎn)量提升至350 mg/L。

3. 蛋白純化結(jié)果

經(jīng)某品牌AKTA純化系統(tǒng)兩步純化，獲得純度>95%的重組胱抑素C。陽(yáng)離子交換層析顯示胱抑素C在0.3 M NaCl處洗脫，分子篩層析確認(rèn)其為單體形式。最終得率為65%，比活性為XX U/mg。

4. 免疫原性分析

某品牌ELISA試劑檢測(cè)顯示，免疫小鼠血清效價(jià)達(dá)1:128000。某品牌Western blot試劑證實(shí)抗體特異性識(shí)別約13 kDa的重組胱抑素C條帶，與理論分子量一致。

討論

研究成功實(shí)現(xiàn)了胱抑素C在巴斯德畢赤酵母中的高效分泌表達(dá)。通過(guò)系統(tǒng)優(yōu)化培養(yǎng)條件和誘導(dǎo)參數(shù)，蛋白產(chǎn)量顯著提高。與已報(bào)道的大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)相比，酵母表達(dá)的重組胱抑素C具有正確的空間結(jié)構(gòu)，無(wú)需復(fù)性處理，且分泌表達(dá)簡(jiǎn)化了下游純化流程。

溫度對(duì)蛋白表達(dá)影響顯著，25℃誘導(dǎo)可減少包涵體形成，提高可溶性蛋白比例。pH 6.0接近胱抑素C等電點(diǎn)，可能減少蛋白酶降解。1.0%甲醇濃度既能維持足夠誘導(dǎo)強(qiáng)度，又避免甲醇毒性。補(bǔ)料培養(yǎng)策略有效解決了高密度培養(yǎng)時(shí)的底物限制問(wèn)題。

免疫實(shí)驗(yàn)證實(shí)重組胱抑素C具有良好免疫原性，產(chǎn)生高效價(jià)特異性抗體。這為開(kāi)發(fā)胱抑素C檢測(cè)試劑盒及研究其生物學(xué)功能提供了重要工具。

結(jié)論

巴斯德畢赤酵母高效分泌表達(dá)胱抑素C的工藝體系，優(yōu)化后的表達(dá)量達(dá)350 mg/L，純化產(chǎn)物純度>95%。免疫實(shí)驗(yàn)證實(shí)其具有良好的免疫原性，為胱抑素C的臨床應(yīng)用及相關(guān)研究提供了可靠材料。該表達(dá)系統(tǒng)具有工業(yè)化放大潛力，可為胱抑素C的大規(guī)模生產(chǎn)提供新途徑。

參考文獻(xiàn)

1. 豬生長(zhǎng)激素基因在巴斯德畢赤酵母中的高效分泌表達(dá)及產(chǎn)物的N-糖基化分析 [J] . 歐陽(yáng)菁 ,楊林 ,龍綮新 . 生物工程學(xué)報(bào) . 2001,第005期

2. 過(guò)表達(dá)PDI對(duì)畢赤酵母分泌淀粉樣蛋白的影響——以胱抑素為例 [J] . 牛婷婷 ,周雪潔 ,余小波 . 微生物學(xué)報(bào) . 2021,第010期

3. 舍格倫綜合征A抗原(SSA60)在巴斯德畢赤酵母中的高效分泌表達(dá)及膠體金快速檢測(cè)方法的建立 [J] . 楊湘越 ,蘭小鵬 ,徐秀云 . 現(xiàn)代檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志 . 2009,第001期

4. 人干燥綜合征B抗原在巴斯德畢赤酵母中的高效分泌表達(dá)研究 [J] . 楊湘越 ,蘭小鵬 ,吳文冰 . 福州總醫(yī)院學(xué)報(bào) . 2007,第003期

5. 人干燥綜合征B抗原在巴斯德畢赤酵母菌中的高效分泌表達(dá)研究 [J] . 楊湘越 ,蘭小鵬 ,吳文冰 . 醫(yī)學(xué)研究生學(xué)報(bào) . 2006,第011