摘要
多細(xì)胞因子（IL-2、TNF-α、IFN-γ）聯(lián)合HSV-TK/GCV基因系統(tǒng)對(duì)膀胱癌的協(xié)同抑制作用。通過(guò)體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)及小鼠皮下移植瘤模型，驗(yàn)證聯(lián)合治療對(duì)腫瘤增殖的抑制效果及免疫調(diào)節(jié)機(jī)制。結(jié)果顯示，聯(lián)合組較單一治療組顯著降低腫瘤體積（P<0.01），并激活CD8+ T細(xì)胞浸潤(rùn)。

引言

膀胱癌是泌尿系統(tǒng)常見(jiàn)惡性腫瘤，傳統(tǒng)化療易產(chǎn)生耐藥性且免疫抑制微環(huán)境限制療效?；虔煼ㄍㄟ^(guò)前藥轉(zhuǎn)換特異性殺傷腫瘤細(xì)胞，但單一基因治療存在靶向性不足及免疫激活有限等問(wèn)題。多細(xì)胞因子可通過(guò)調(diào)節(jié)免疫微環(huán)境增強(qiáng)抗腫瘤效應(yīng)，但其與基因的協(xié)同機(jī)制尚未明確。本研究設(shè)計(jì)靶向膀胱癌特異性抗原的遞送系統(tǒng)，聯(lián)合多細(xì)胞因子與HSV-TK/GCV系統(tǒng)，旨在通過(guò)直接殺傷與免疫激活雙重途徑抑制腫瘤進(jìn)展。

材料與方法

1. 實(shí)驗(yàn)材料

細(xì)胞與動(dòng)物：人膀胱癌細(xì)胞系T24、MB49；BALB/c裸鼠及C57BL/6小鼠（6周齡）。

試劑：某試劑（重組質(zhì)粒pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro）、某試劑（GCV前藥）、某試劑（ELISA檢測(cè)試劑盒）。

儀器：威尼德電穿孔儀（轉(zhuǎn)染效率>80%）、威尼德紫外交聯(lián)儀（DNA固定）、威尼德分子雜交儀（蛋白印跡分析）。

2. 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 質(zhì)粒構(gòu)建與轉(zhuǎn)染

構(gòu)建靶向EpCAM的多細(xì)胞因子融合質(zhì)粒（IL-2/TNF-α/IFN-γ），并與HSV-TK基因共轉(zhuǎn)染至T24細(xì)胞。使用威尼德電穿孔儀（參數(shù)：電壓120 V，脈沖時(shí)長(zhǎng)20 ms），篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)染株（Puromycin 2 μg/mL，72 h）。

2.2 體外細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)

將轉(zhuǎn)染細(xì)胞分為四組：對(duì)照組、細(xì)胞因子組、HSV-TK/GCV組、聯(lián)合組。加入GCV（10 μM）處理48 h，CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞存活率，流式細(xì)胞術(shù)分析凋亡（Annexin V/PI雙染）。

2.3 動(dòng)物模型建立

將MB49細(xì)胞接種于C57BL/6小鼠右脅皮下（5×10^6個(gè)/只），腫瘤體積達(dá)100 mm3后隨機(jī)分組（n=8），分別注射PBS、細(xì)胞因子、HSV-TK/GCV及聯(lián)合治療。每3天監(jiān)測(cè)腫瘤體積（公式：V=0.5×長(zhǎng)徑×短徑2）。

2.4 免疫組化與流式分析

取瘤組織石蠟切片，CD31抗體檢測(cè)血管生成，CD8+ T細(xì)胞標(biāo)記分析浸潤(rùn)程度。脾臟單細(xì)胞懸液經(jīng)某試劑染色，威尼德流式細(xì)胞儀檢測(cè)T細(xì)胞亞群比例。

結(jié)果

聯(lián)合治療顯著抑制腫瘤增殖

體外實(shí)驗(yàn)中，聯(lián)合組細(xì)胞存活率（23.4±3.1%）顯著低于單一治療組（細(xì)胞因子組：58.7±4.2%；HSV-TK組：45.6±5.1%，P<0.01）。

小鼠模型中，聯(lián)合組腫瘤體積較對(duì)照組減少78.3%（第21天，197.2±21.5 mm3 vs. 912.4±89.7 mm3）。

免疫微環(huán)境重塑

聯(lián)合組瘤內(nèi)CD8+ T細(xì)胞比例升高至42.1±3.8%（對(duì)照組：8.5±1.2%），血管密度降低56%。

討論

本研究證實(shí)多細(xì)胞因子可通過(guò)激活Th1型免疫反應(yīng)增強(qiáng)HSV-TK/GCV的旁觀者效應(yīng)。IL-2促進(jìn)T細(xì)胞增殖，TNF-α誘導(dǎo)腫瘤血管壞死，IFN-γ上調(diào)MHC-I表達(dá)，三者協(xié)同克服了單一基因療法的免疫逃逸缺陷。威尼德電穿孔儀的高效轉(zhuǎn)染為基因遞送提供了技術(shù)保障。未來(lái)需優(yōu)化靶向載體以減少脫靶毒性。

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