一、引言

南荻（Miscanthus lutarioriparius）作為一種重要的多年生高大禾本科植物，在生物質(zhì)能源、造紙、紡織等領(lǐng)域展現(xiàn)出巨大的應(yīng)用潛力。其具有生物量大、纖維素含量高、適應(yīng)性強(qiáng)等優(yōu)良特性，是理想的可再生能源原料之一。然而，傳統(tǒng)的南荻品種改良方法存在周期長(zhǎng)、效率低等局限性，難以滿足現(xiàn)代生物質(zhì)產(chǎn)業(yè)對(duì)南荻優(yōu)良品種的需求。隨著基因工程技術(shù)的發(fā)展，建立南荻遺傳轉(zhuǎn)化系統(tǒng)成為突破這一瓶頸的關(guān)鍵。通過(guò)遺傳轉(zhuǎn)化，可以將有益基因?qū)肽陷?，?shí)現(xiàn)對(duì)其性狀的精準(zhǔn)改良，從而提高南荻的利用價(jià)值，促進(jìn)相關(guān)產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。

二、材料與方法

（一）植物材料

采集野生或栽培的健康南荻成熟種子、幼嫩莖段和葉片作為外植體材料。將采集的材料用清水沖洗干凈，去除表面的雜質(zhì)和灰塵，然后在 70% 的乙醇溶液中浸泡 30 - 60 秒，再用含有 0.1% - 0.2% HgCl?的消毒液浸泡 8 - 12 分鐘，最后用無(wú)菌水沖洗 3 - 5 次，備用。

（二）培養(yǎng)基的配制

誘導(dǎo)培養(yǎng)基

以 MS 基本培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，添加 2,4 - D（2 - 4mg/L）、6 - BA（0.5 - 1mg/L）、蔗糖（30g/L）和瓊脂（7g/L），pH 調(diào)至 5.8 - 6.0。該培養(yǎng)基用于誘導(dǎo)外植體產(chǎn)生愈傷組織。

繼代培養(yǎng)基

MS 培養(yǎng)基添加 NAA（0.5 - 1mg/L）、KT（0.2 - 0.5mg/L）、蔗糖（30g/L）和瓊脂（7g/L），pH 5.8 - 6.0。用于愈傷組織的繼代培養(yǎng)，保持愈傷組織的生長(zhǎng)狀態(tài)和增殖能力。

分化培養(yǎng)基

MS 培養(yǎng)基中加入 6 - BA（1 - 2mg/L）、IAA（0.5 - 1mg/L）、蔗糖（30g/L）和瓊脂（7g/L），pH 5.8 - 6.0。促使愈傷組織分化形成芽。

生根培養(yǎng)基

1/2MS 培養(yǎng)基，添加 IBA（0.5 - 1mg/L）、蔗糖（20g/L）和瓊脂（7g/L），pH 5.8 - 6.0。用于誘導(dǎo)芽生根，形成完整的植株。

（三）愈傷組織的誘導(dǎo)

種子誘導(dǎo)

將消毒后的南荻種子接種到誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，在溫度為 25 ± 2℃、光照強(qiáng)度為 1500 - 2000lx、光照時(shí)間為 12 - 16 小時(shí) / 天的條件下培養(yǎng)。觀察種子萌發(fā)和愈傷組織的產(chǎn)生情況，一般在培養(yǎng) 2 - 3 周后開(kāi)始出現(xiàn)淡黃色、質(zhì)地疏松的愈傷組織。

莖段和葉片誘導(dǎo)

將消毒后的莖段和葉片切成約 0.5 - 1cm 的小段或小塊，接種到誘導(dǎo)培養(yǎng)基上。培養(yǎng)條件同種子誘導(dǎo)，但莖段和葉片誘導(dǎo)愈傷組織的時(shí)間可能稍長(zhǎng)，約 3 - 4 周，且不同外植體的誘導(dǎo)率有所差異。對(duì)誘導(dǎo)出的愈傷組織根據(jù)其質(zhì)地、顏色等特征進(jìn)行篩選，選擇生長(zhǎng)旺盛、質(zhì)地疏松且顏色均勻的愈傷組織用于后續(xù)培養(yǎng)。

（四）農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化

農(nóng)桿菌菌株及載體構(gòu)建

選用合適的農(nóng)桿菌菌株（如 LBA4404），將目的基因構(gòu)建到含有合適啟動(dòng)子（如 CaMV35S 啟動(dòng)子或南荻自身的強(qiáng)啟動(dòng)子）和篩選標(biāo)記基因（如潮霉素抗性基因）的雙元載體上。通過(guò)電擊轉(zhuǎn)化或熱激轉(zhuǎn)化等方法將構(gòu)建好的載體導(dǎo)入農(nóng)桿菌中。

共培養(yǎng)

將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的農(nóng)桿菌菌液離心收集，用液體 MS 培養(yǎng)基重懸至 OD??? = 0.5 - 0.8。將篩選好的南荻愈傷組織浸泡在農(nóng)桿菌菌液中 10 - 20 分鐘，然后取出用無(wú)菌濾紙吸干多余菌液，接種到共培養(yǎng)培養(yǎng)基上（MS 培養(yǎng)基添加乙酰丁香酮 100 - 200μM），在黑暗條件下 22 - 25℃共培養(yǎng) 2 - 3 天。

篩選培養(yǎng)

共培養(yǎng)結(jié)束后，將愈傷組織用含有頭孢噻肟鈉（200 - 500mg/L）的無(wú)菌水沖洗 3 - 5 次，以去除表面多余的農(nóng)桿菌。然后將愈傷組織轉(zhuǎn)移到含有篩選劑（如潮霉素，根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)確定合適濃度，一般為 20 - 50mg/L）的篩選培養(yǎng)基（繼代培養(yǎng)基中添加篩選劑）上進(jìn)行篩選培養(yǎng)。每 2 - 3 周更換一次培養(yǎng)基，持續(xù)篩選 2 - 3 個(gè)月，直至獲得穩(wěn)定的抗性愈傷組織。

（五）再生植株的獲得與鑒定

分化與生根

將篩選得到的抗性愈傷組織轉(zhuǎn)移到分化培養(yǎng)基上，在光照條件下培養(yǎng)，促進(jìn)芽的分化。待芽長(zhǎng)至 2 - 3cm 時(shí)，將其切下轉(zhuǎn)移到生根培養(yǎng)基上誘導(dǎo)生根，形成完整的再生植株。

分子鑒定

采用 PCR 技術(shù)對(duì)再生植株進(jìn)行初步鑒定，以目的基因特異性引物和篩選標(biāo)記基因引物進(jìn)行擴(kuò)增，檢測(cè)目的基因是否整合到南荻基因組中。對(duì)于 PCR 陽(yáng)性植株，進(jìn)一步采用 Southern blotting 分析目的基因的拷貝數(shù)，以及 Northern blotting 或?qū)崟r(shí)定量 PCR 檢測(cè)目的基因在轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)情況，確保目的基因在南荻中穩(wěn)定表達(dá)且發(fā)揮預(yù)期功能。

三、結(jié)果

（一）愈傷組織誘導(dǎo)結(jié)果

通過(guò)不同外植體和不同培養(yǎng)基的組合實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)種子和幼嫩莖段在誘導(dǎo)培養(yǎng)基上的愈傷組織誘導(dǎo)率較高，分別可達(dá) 70% - 80% 和 60% - 70%，而葉片的誘導(dǎo)率相對(duì)較低，約為 40% - 50%。誘導(dǎo)出的愈傷組織在繼代培養(yǎng)基上能夠保持良好的生長(zhǎng)狀態(tài)，經(jīng)過(guò)多次繼代后仍具有較高的增殖能力。

（二）遺傳轉(zhuǎn)化結(jié)果

經(jīng)過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化和篩選培養(yǎng)，獲得了具有潮霉素抗性的愈傷組織。在分化和生根培養(yǎng)后，成功獲得了再生植株。分子鑒定結(jié)果表明，部分再生植株中檢測(cè)到目的基因的整合和表達(dá)，證明成功建立了南荻的遺傳轉(zhuǎn)化系統(tǒng)。通過(guò)優(yōu)化轉(zhuǎn)化條件，如農(nóng)桿菌菌液濃度、共培養(yǎng)時(shí)間等，可將轉(zhuǎn)化效率提高到一定水平，為后續(xù)的基因工程應(yīng)用提供了足夠數(shù)量的轉(zhuǎn)化植株。

四、討論

（一）組織培養(yǎng)條件的優(yōu)化

在南荻愈傷組織誘導(dǎo)過(guò)程中，外植體的類型和生理狀態(tài)對(duì)誘導(dǎo)率有著重要影響。幼嫩的外植體通常具有更高的誘導(dǎo)潛力，這可能是由于其細(xì)胞的分化程度較低，具有更強(qiáng)的再生能力。培養(yǎng)基中的激素種類和濃度是另一個(gè)關(guān)鍵因素，不同激素組合對(duì)于愈傷組織的誘導(dǎo)、增殖和分化有著不同的調(diào)控作用。在本研究中，通過(guò)多次試驗(yàn)確定的激素濃度和比例有效地促進(jìn)了南荻愈傷組織的形成和生長(zhǎng)。

（二）遺傳轉(zhuǎn)化效率的提高

農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化過(guò)程中，多個(gè)環(huán)節(jié)影響轉(zhuǎn)化效率。農(nóng)桿菌菌株的選擇、載體的構(gòu)建以及共培養(yǎng)條件等都需要精細(xì)優(yōu)化。乙酰丁香酮的添加在共培養(yǎng)過(guò)程中能夠顯著提高轉(zhuǎn)化效率，可能是通過(guò)激活農(nóng)桿菌的 Vir 基因表達(dá)，促進(jìn) T - DNA 向植物細(xì)胞的轉(zhuǎn)移。篩選劑的濃度和篩選時(shí)間也需要謹(jǐn)慎確定，過(guò)高的濃度可能導(dǎo)致假陽(yáng)性或抑制愈傷組織的生長(zhǎng)，而過(guò)低則無(wú)法有效篩選出真正的轉(zhuǎn)化體。

（三）在基因工程中的應(yīng)用前景

建立的南荻遺傳轉(zhuǎn)化系統(tǒng)為南荻的基因工程應(yīng)用開(kāi)辟了廣闊的道路。通過(guò)導(dǎo)入抗逆基因，可以提高南荻對(duì)干旱、鹽堿等惡劣環(huán)境的適應(yīng)能力，擴(kuò)大其種植范圍。導(dǎo)入與纖維素合成或降解相關(guān)的基因，有望進(jìn)一步提高南荻的生物質(zhì)品質(zhì)，優(yōu)化其在生物質(zhì)能源和造紙工業(yè)中的應(yīng)用。此外，利用基因編輯技術(shù)結(jié)合本遺傳轉(zhuǎn)化系統(tǒng)，可以對(duì)南荻的內(nèi)源基因進(jìn)行精準(zhǔn)編輯，創(chuàng)造具有特殊性狀的新種質(zhì)資源。

五、結(jié)論

本研究成功建立了南荻遺傳轉(zhuǎn)化系統(tǒng)，包括外植體消毒、愈傷組織誘導(dǎo)、農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化以及再生植株的獲得和鑒定等環(huán)節(jié)。通過(guò)對(duì)各環(huán)節(jié)的優(yōu)化，提高了轉(zhuǎn)化效率和再生植株的質(zhì)量。該遺傳轉(zhuǎn)化系統(tǒng)在南荻基因工程應(yīng)用方面具有重要價(jià)值，為南荻的品種改良和生物質(zhì)資源開(kāi)發(fā)提供了有力的技術(shù)支撐，將有力推動(dòng)南荻相關(guān)產(chǎn)業(yè)的發(fā)展和對(duì)可再生能源的利用。未來(lái)的研究可以進(jìn)一步完善該系統(tǒng)，拓展其在更多基因功能研究和應(yīng)用領(lǐng)域的潛力。